von Dr. Alexej Dronov
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| [1.] Ad/Fragment 061 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 23:53:57 Hindemith | Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 61, Zeilen: 1-23 |
Quelle: Becker 1999 Seite(n): 24, 25, Zeilen: 24: 1 ff.; 25: 1 ff. |
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| 2.16.3 Die Messwertbestimmung von PCR-Produkten (Quantifizierung)
Zur Bestimmung von Messwerten aus den PCR-Produkten gibt es verschiedene Verfahren mit unterschiedlichen Vorteilen und Problemen. Insgesamt gibt es auch im Forschungsbereich eine Tendenz zu toxikologisch unbedenklichen Verfahren, die dennoch durch gleichzeitig verbesserte Techniken immer sensitiver werden. Radioaktivität Eine der ersten Methoden zur Quantifizierung war die Verwendung von Radioaktivität. Am einfachsten ist die Zugabe einer geringen Menge eines radioaktiven dNTPs zur PCR. Das Nukleotid wird während der PCR in das Produkt eingebaut. Über einen Szintillationszähler kann die Radioaktivität danach gemessen werden (SEIBEL et al. 1991). Von der Verwendung von Radioaktivität ist man heute eher abgekommen. Nicht-radioaktive Methoden sind von vergleichbarer Qualität und umgehen die umständliche Handhabung sowie die Entsorgung. ELISA ALARD stellt 1993 eine qPCR-Methode vor, welche biotinylierte Primer verwendet. Diese werden dann über einen ELISA optisch quantifiziert. Sie konnten IL2 mRNA aus 40 Jurkat Zellen quantifizieren. Anfärbung durch Fluoreszenzfarbstoffe und densitometrische Analyse Die Auftrennung verschiedener DNA-Fragmente mit Hilfe eines Gels und anschließende Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, meist Ethidiumbromid, ist heute eine molekularbiologische Standardmethode. Diese Methode kann einfach zur Bestimmung bei der kompetitiven PCR eingesetzt werden (CHEHADEH et al. 1995). Wegen der mangelnden Sensitivität kann sie jedoch nicht zur Bestimmung von PCR-Produkten bei der kinetischen PCR eingesetzt werden. |
1.4.4 Die Messwertbestimmung von PCR-Produkten (Quantifizierung)
Zur Bestimmung von Messwerten aus den PCR-Produkten gibt es verschiedene Verfahren mit unterschiedlichen Vorteilen und Problemen. Insgesamt gibt es auch im Forschungsbereich eine Tendenz zu toxikologisch unbedenklichen Verfahren, die dennoch durch gleichzeitig verbesserte Techniken immer sensitiver werden. 1.4.4.1 Radioaktivität Eine der ersten Methoden zur Quantifizierung war die Verwendung von Radioaktivität. Am einfachsten ist die Zugabe einer geringen Menge eines radioaktiven dNTPs zur PCR. Das Nukleotid wird während der PCR in das Produkt eingebaut. Über einen Szintillationszähler kann die Radioaktivität danach gemessen werden (Seibel, et al., 1991 a). Von der Verwendung von Radioaktivität ist man heute eher abgekommen. Nicht-radioaktive Methoden sind von vergleichbarer Qualität und umgehen das umständliche handling sowie die Entsorgung. 1.4.4.2 Antikörper Alard stellt 1993 eine qPCR-Methode vor, welche biotinylierte Primer verwendet. Diese werden dann über einen ELISA optisch quantifiziert. Sie konnten bis zu 16 pg eines 250 bp-Fragmentes nachweisen. [Seite 25:] 1.4.4.4 Anfärbung durch Fluoreszenzfarbstoffe Die Auftrennung verschiedener DNA-Fragment mit Hilfe eines Gels und anschließende Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoffs, meist Ethidiumbromid, ist heute eine molekularbiologische Standardmethode. Sie eignet sich zum Vergleichen etwa gleicher, großer Mengen an DNA. Diese Methode kann einfach zur Bestimmung bei der kompetitiven PCR eingesetzt werden (Chehadeh et al., 1995). Wegen der mangelnden Sensitivität kann sie jedoch nicht zur Bestimmung von PCR-Produkten bei der kinetischen PCR eingesetzt werden. |
Kein Hinweis auf die Quelle. |
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| [2.] Ad/Fragment 061 24 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-08 09:23:30 Hindemith | Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 61, Zeilen: 24-31 |
Quelle: Bente 2003 Seite(n): 19, Zeilen: 26 ff. |
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| Eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an RNA bzw. DNA kann nach einer PCR durch die Bestimmung der Dicke der Banden im Agarose-Gel erfolgen. Diese Extrapolation ist nicht in jedem Fall korrekt. Es handelt sich hierbei um die Endpunktbetrachtung einer PCR. Die Kinetik der Reaktion (z.B. Variationen der Effektivität) wird dabei nicht beachtet. Die Effektivität kann durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst werden wie z.B. Primer- und Pufferkonzentrationen. Auch der Zeitpunkt der Durchführung kann eine Rolle spielen. Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocycler [führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf zu Lauf.] | Eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an RNA bzw. DNA kann nach einer PCR durch die Bestimmung der Dicke der Banden im Agarose-Gel erfolgen. Diese Extrapolation ist nicht in jedem Fall korrekt. Es handelt sich hierbei um die Endpunktbetrachtung einer PCR. Die Kinetik der Reaktion (z.B. Variationen der Effektivität) wird dabei nicht beachtet. Die Effektivität kann durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst werden: wie z.B. Primer- und Pufferkonzentrationen. Auch der Zeitpunkt der Durchführung kann eine Rolle spielen. Variationen in der Qualität und in den Volumina der einzelnen Reaktionskomponenten (bedingt durch Pipettierfehler), sowie Variationen im Temperaturprofil des Thermocyclers, führen zu einer Variation der Effektivität der PCR von Lauf-zu-Lauf. |
Kein Hinweis auf die Quelle. |
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