von Dr. Alexej Dronov
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| [1.] Ad/Fragment 098 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 00:14:36 Hindemith | Ad, Becker 1999, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 98, Zeilen: 1-16, 19-30 |
Quelle: Becker 1999 Seite(n): 47, 57, 59, 73, 92, Zeilen: 47: 18ff; 57: 2 ff.; 59: 3 ff.; 73: 11 ff.; 92: 12ff |
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| [Bei der limiting dilution PCR wird die DNA wesentlich stärker verdünnt (bis keine Amplifikationsprodukte] mehr entstehen können!) und die Auswertung erfolgt in Form von diskreten Ja-Nein-Ereignissen über eine Poisson-Verteilung.
3.3.4.10 Fotodokumentation und Quantifizierung Zur Quantifizierung von PCR-Produkten werden digitale Aufnahmen von Agarosegelen verwendet. Das Programm „Gel-Pro Analyzer“ ermöglicht eine Quantifizierung von eindimensionalen Gelaufnahmen und die Darstellung der Bandenintensität In OD (Optische Dichte, oder Extinktion in der Photometrie). Optische Dichte ist die logarithmische Funktion der Transmission. Während bei der Photometrie direkt die OD bestimmt wird (z.B. bei der photometrischen Quantifizierung der DNA), ist dies bei einer Kamera oder einem Scanner nicht möglich. Alle erhaltenen Werte sind relative Aussagen, weil es sich sehr schwierig gestaltet, ein Aufnahmesystem optimal einzustellen und zu kalibrieren, um die Absolutmengen berechnen zu können. Die Aufnahmen zeigten oft geringfügig dunklere Werte im Außenbereich als in der Mitte. Dieser Fehler ist wahrscheinlich von den optischen Linsen erzeugt, da er radiär erscheint. Diese Inhomogenität würde einen systematischen, leicht zu umgehenden Fehler erzeugen. Banden in der Mitte hätten andere Werte als die gleiche DNA-Menge in einer Randzone. [...] Alle Aufnahmen von Gelen haben neben den fluoreszierenden DNA-Banden auch einen nicht ganz schwarzen Hintergrund durch die unspezifische Fluoreszenz der verwendeten Farbstoffe. Dieser Hintergrund muß optisch oder rechnerisch entfernt werden, um die DNA-Banden eines Gels auswerten zu können. Der Hintergrund einer Aufnahme läßt sich mit Gel-Pro Analyzer automatisch subtrahieren. Dabei wird ein sogenanntes „Join Valleys“ Tool mit einem vorher bestimmten Durchmesser über das Bild gefahren und aus diesen Daten der Hintergrund von den Bandenintensitäten unterschieden und gleichzeitig subtrahiert. Bei der Quantifizierung großer DNA-Mengen auf einem Gel zeigt sich oft ein sogenannter Halo. Um die eigentliche Bande herum befindet sich ein Lichthof in der Aufnahme. Dieser entsteht, besonders bei dickeren Gelen, durch Streustrahlung der gefärbten DNA horizontal in das Gel. Dieses Phänomen zeigt sich deutlich sowohl auf der Aufnahme als auch auf dem Quantifizierungsplot. Eine theoretische Lösung dieses Problems konnte nicht gezeigt werden. |
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Zur Quantifizierung von PCR-Produkten werden Videoaufnahmen von Agarosegelen verwendet. Es wurden im Laufe der Zeit zwei verschiedene Systeme eingesetzt. [Seite 57:] Alle Aufnahmen von Gelen haben neben den fluoreszierenden DNA-Banden auch einen nicht ganz schwarzen Hintergrund durch die unspezifische Fluoreszenz der verwendeten Farbstoffe (s. a. Abbildung 3 in Kapitel 4.7). Dieser Hintergrund muß optisch oder rechnerisch entfernt werden, um die DNA-Banden eines Gels auswerten zu können. Der Hintergrund einer Aufnahme läßt sich mit NIH Image automatisch subtrahieren. Dabei wird ein sogenannter rolling ball mit einem vorher bestimmten Durchmesser über das Bild gefahren und aus diesen Daten der Hintergrund von den Bandenintensitäten unterschieden und gleichzeitig subtrahiert. [...] Optische Dichte (OD, oder Extinktion in der Photometrie) ist die logarithmische Funktion der Transmission. Während bei der Photometrie direkt die OD bestimmt wird (z.B. bei der photometrischen Quantifizierung der DNA), ist dies bei einer CCDKamera oder einem Scanner nicht möglich. Alle erhaltenen Werte sind relative Aussagen, deshalb muß immer ein Standard auf der gleichen Aufnahme mitbestimmt werden, um die Absolutmengen berechnen zu können. [Seite 59:] Die Aufnahmen zeigten geringfügig dunklere Werte (10 von 256) im Aussenbereich als in der Mitte. Dieser Fehler ist wahrscheinlich von den optischen Linsen erzeugt, da er radiär erscheint. Diese Inhomogenität würde einen systematischen, leicht zu umgehenden Fehler erzeugen. Banden in der Mitte hätten andere Werte als die gleiche DNA-Menge in einer Randzone. [Seite 73:] Bei der Quantifizierung großer DNA-Mengen auf einem Gel (ab ca. 20 ng pro Spur) zeigt sich oft ein sogenannter Halo. Um die eigentliche Bande herum befindet sich ein Lichthof in der Aufnahme. Dieser entsteht, besonders bei dickeren Gelen, durch Streustrahlung der gefärbten DNA horizontal in das Gel. Dieses Phänomen zeigt sich deutlich sowohl auf der Aufnahme als auch auf dem Quantifizierungsplot. Eine theoretische Lösung dieses Problems konnte nicht gezeigt werden. In dieser Arbeit wurde es als Artefakt gewertet und zusammen mit dem sonstigen Hintergrund geometrisch in dem Quantifizierungsplot abgetrennt. [Seite 92:] Bei der limiting dilution PCR wird die DNA wesentlich stärker verdünnt (bis keine Amplifikationsprodukte mehr entstehen können!) und die Auswertung erfolgt in Form von diskreten Ja-Nein-Ereignissen über die Poisson-Verteilung, (s. a. Kapitel 1.4.3.3). |
Kein Hinweis auf die Quelle. |
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