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Funktionelle und molekularbiologische Parameter zum Nachweis immunmodulatorischer Wirkungen: Dargestellt an unterschiedlichen Zellpopulationen von Pferden mit und ohne Sommerekzem

von Dr. Alexej Dronov

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[1.] Ad/Fragment 100 08 - Diskussion
Zuletzt bearbeitet: 2014-07-09 23:27:53 Hindemith
Ad, Bente 2003, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung

Typus
Verschleierung
Bearbeiter
SleepyHollow02
Gesichtet
Yes
Untersuchte Arbeit:
Seite: 100, Zeilen: 8-20
Quelle: Bente 2003
Seite(n): 80 f., Zeilen: 80. 24 ff.; 81 1 ff.
3.3.5 SYBR Green TM real-time PCR

Für die Etablierung eines Sybr Green™ PCR-Protokolls wurde das Brilliant™ SYBR Green QPCR Master Mix™ Kit (s.3.2.2) verwendet.

Die Synthese der cDNA erfolgte nach gleichem Protokoll (s.3.3.4.6) wie für konventionelle PCR. Für die SYBR Green™ PCR wurden 4 μl der synthetisierten cDNA mit 25 μl des zweifach konzentrierten Mastermixes, sowie 1 μl eines Primers (10 pmol), 0,75 μl des vorher 1 zu 500 verdünnten Referenzfarbstoffes ROX (Endkonzentration 30 nM) und 18,25 μl sterilen Wassers (s.3.2.2) vorsichtig in einem 0,5 ml QRT-PCR Reaktionsgefäß (s.3.2.1) gemischt. Der Mastermix beinhaltete dabei folgendes: MgCl2, dNTPs, Tris-HCl, KCl, SureStart™ Taq-Polymerase. Angaben zur Konzentration dieser Ionen wurden vom Hersteller nicht gemacht. Nach der Mischung aller Reaktionskomponenten wurde das Reaktionsgefäß in das real-time PCR Gerät (Mx 4000, STRATAGENE; s.3.1) überführt und folgendes Programm gestartet:

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3.2.7 SYBR Green™ real-time PCR

Für die Etablierung eines Sybr Green™ PCR-Protokolls wurde das Brilliant™ SYBR Green QPCR Master Mix™ Kit (9.2.1) verwendet.

Die Synthese der cDNA erfolgte nach einem laboreigenen optimierten Protokoll (siehe Protokoll 6) in einem 40 μl Reaktionsansatz in 0,5 ml-Reaktionsgefäßen. Für die SYBR Green™ PCR wurden 6 μl für Protokoll 2 und 4 μl für Protokoll 6 der synthetisierten cDNA mit 25 μl des zweifach konzentrierten Mastermixes, sowie 1 μl eines Primers ([10 pmol] - Protokoll 2; [50 pmol] - Protokoll 6), 0,75 μl des vorher 1 zu 500 verdünnten Referenzfarbstoffes ROX (Endkonzentration 30 nM) und 16,25 μl bzw. 18,25 μl sterilen Wassers (9.3.6) vorsichtig in einem 0,5 μl QRT-PCR Reaktionsgefäß (9.6.2) gemischt. Der Mastermix beinhaltete dabei folgende Ionen: MgCl2, dNTPs, Tris-HCl, KCl, SureStart™ Taq-Polymerase. Angaben zur Konzentration dieser Ionen wurden vom Hersteller nicht gemacht (9.2.1).

[Seite 81:]

Nach der Mischung aller Reaktionskomponenten wurde das Reaktionsgefäß in das real-time PCR Gerät (Mx 4000, STRATAGENE; 9.7) überführt und folgendes Programm gestartet:

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Anmerkungen

Kein Hinweis auf die Quelle.

Sichter
(SleepyHollow02), Hindemith


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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Hindemith, Zeitstempel: 20140709232836
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