von Dr. Alexej Dronov
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| [1.] Ad/Fragment 168 04 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-10 01:20:39 Hindemith | Ad, BauernOpfer, Fragment, Gesichtet, Krueger 2001, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 168, Zeilen: 4-31 |
Quelle: Krueger 2001 Seite(n): 105-106, Zeilen: 105:29-32 - 106:1-19.23-35 |
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| 5.1.3 Die Quantifizierung des Zelltodes
Wie beurteilt man am zuverlässigsten Vitalitäts-beeinflussende Effekte auf Zellen in vitro? Unterstellt man, dass in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle die Apoptose von Zellen induziert oder gehemmt wird, so könnte der positive Nachweis apoptotischer Merkmale von Zellen ausreichend erscheinen. So wird in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen sehr häufig die Bindung von Fluorochrom-markiertem Annexin V an das Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Zellen verwendet (FADOK et al. 2000). Die Induktion der Apoptose wurde auch durch den Nachweis der Caspase-Aktivitäten mit Hilfe Fluorochrom-markierter Caspase-Substrate durchflußzytometrisch gemessen (ALAM et al. 1999). LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON. (1999) identifizierten Apoptose in ihrer Arbeit anhand einer durchflußzytometrisch bestimmten Größenabnahme (geringerer FSC) der Zellen. Der Grund, in dieser Arbeit von einem direkten Apoptose-Nachweis abzusehen, lag in der Beobachtung, dass apoptotische Zellen in vitro relativ schnell sekundär nekrotisch werden können (WALSH et al. 1998), was somit den Nachweis einer primären Apoptose-Induktion erschwert hätte. Zudem sind die Zeitfenster, in dem Unterschiede in der Apoptose in den verschiedenen Ansätzen in vitro nachweisbar sind, oft sehr kurz, und bergen (bei falscher Wahl der Meßzeitpunkte oder unterschiedlichen Apoptose-Kinetiken) die Gefahr von Fehlinterpretationen. Sekundär nekrotische Zellen stellen sich nach durchflußzytometrischer Analyse als Propidiumiodid-positiv dar. Solche noch als Zellen zu identifizierende Ereignisse desintegrieren jedoch sehr rasch (Membran-, Kernfragmente) (KRÜGER 2001), so dass auch dieser Parameter nur bedingt zum Nachweis eines induzierten Zelltodes geeignet schien. Auf diesen Überlegungen basierte die Auswahl des dargestellten quantitativen durchflußzytometrischen Verfahrens zur Prüfung der Modulation der Zellvitalität. Prinzipiell wurden die, nach bestimmten Zeiten in vitro noch nachweisbaren, vitalen Zellen gezählt und als verläßlichster Parameter der Zellvitalität in vitro angesehen. Es kann aus den dargelegten Gründen nicht mit Bestimmtheit festgelegt werden, ob das im folgenden beschriebene beschleunigte Absterben auf der Induktion von Apoptose oder der Nekrose beruht, oder ob eventuell sogar beide Mechanismen des Zelltodes daran beteiligt sind. Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod von PBL in vivo und in vitro generell die Induktion [der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998).] ALAM A, COHEN LY, AOUAD S & SÉKALY RP. (1999) : FADOK VA, BRATTON DL, ROSE DM, PEARSON A, EZEKEWITZ RA, HENSON PM. (2000) : GASMI L , MCLENNAN AG & EDWARDS SW. (1996) : HANNAH S, NADRA I, DRANSFIELD I, PRYDE JG, ROSSI AG & HASLET C. (1998) : HASLETT C, GUTHRIE LA, KOPANIAK RB JOHNSTON & HENSON PM. (1985) : KRÜGER C. (2001) : LUNDQVIST-GUSTAFSSON H & BENGTSSON T. (1999) : PAYNE CM, GLASSER L, TISCHLER ME, WYCKOFF D, CROMEY D, FIEDERLEIN E & BOHNERT O. (1994) : WALSH GM, DEWSON G, WARDLAW AJ, LEVI-SCHAFFER F & R MOQBEL. (1998) : WALZOG B, JEBLONSKI F, ZAKRZEWICZ A & GAEHTGENS P. (1997) : |
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5.1.1 Methodischer Ansatz Wie beurteilt man am zuverlässigsten Vitalitäts-mindernde Effekte von Toxinen, Superantigenen oder zellulären Mediatoren auf Zellen in vitro? Unterstellt man, daß in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle die Apoptose von Zellen induziert oder gehemmt wird, so könnte der positive Nachweis apoptotischer Merkmale von Zellen (vgl. Abb. 1) [Seite 106] ausreichend erscheinen. So wird in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen sehr häufig die Bindung von Fluorochrom-markiertem Annexin V an das Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Zellen verwendet (s. 2.4.1, FADOK et al. 1992). Die Induktion der Apoptose wurde auch durch den Nachweis der Caspase-Aktivitäten mit Hilfe Fluorochrom-markierter Caspase-Substrate durchflußzytometrisch gemessen (ALAM et al. 1999). LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON (1999) identifizierten Apoptose in ihrer Arbeit anhand einer durchflußzytometrisch bestimmten Größenabnahme (geringerer FSC) der Zellen. Der Grund, in dieser Arbeit von einem direkten Apoptose-Nachweis abzusehen, lag in der Beobachtung, daß apoptotische Zellen in vitro relativ schnell sekundär nekrotisch werden können (WALSH et al. 1998), was somit den Nachweis einer primären Apoptose-Induktion erschwert hätte. Zudem sind die Zeitfenster, in dem Unterschiede in der Apoptose - in den verschiedenen Ansätzen - in vitro nachweisbar sind, oft sehr kurz, und bergen (bei falscher Wahl der Meßzeitpunkte oder unterschiedlichen Apoptose-Kinetiken) die Gefahr von Fehlinterpretationen. Sekundär nekrotische Zellen stellen sich nach durchflußzytometrischer Analyse als Propidiumiodid-positiv dar (vgl. auch Abb. 5). Solche, noch als Zellen zu identifizierende, Ereignisse desintegrieren jedoch sehr rasch (Membran-, Kernfragmente), so daß auch dieser Parameter nur bedingt zum Nachweis eines induzierten Zelltodes geeignet schien. [...] Auf diesen Überlegungen basierte die Auswahl des dargestellten quantitativen durchflußzytometrischen Verfahrens zur Prüfung der Modulation der Zellvitalität. Prinzipiell wurden die, nach bestimmten Zeiten in vitro noch nachweisbaren, vitalen Zellen gezählt und als verläßlichster Parameter der Zellvitalität in vitro angesehen. Es kann aus den dargelegten Gründen nicht mit Bestimmtheit festgelegt werden, ob das im folgenden beschriebene beschleunigte Absterben der neutrophilen Granulozyten auf der Induktion von Apoptose oder der Nekrose beruht, oder ob eventuell sogar beide Mechanismen des Zelltodes daran beteiligt sind. Allerdings wird für den spontanen und den induzierten Zelltod polymorphkerniger Granulozyten in vivo und in vitro generell die Induktion der Apoptose verantwortlich gemacht (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998), obgleich über die einzelnen, regulierenden Kontrollmechanismen immer noch wenig bekannt ist (WALZOG et al. 1997, TSUCHIDA et al. 1995). ALAM, A., L.Y. COHEN, S. AOUAD & R.-P. SÉKALY (1999) FADOK, V.A., D.R. VOELKER, P.A. CAMPBELL, J.J. COHEN, D.L. BRATTON & P.M. HENSON (1992) GASMI, L., A.G. MCLENNAN & S.W. EDWARDS (1996) HANNAH, S., I. NADRA, I. DRANSFIELD, J.G. PRYDE, A.G. ROSSI & C. HASLETT (1998) HASLETT, C., L.A. GUTHRIE, M.M.KOPANIAK, R.B. JOHNSTON & P.M. HENSON (1985) LUNDQVIST-GUSTAFSSON, H., & T. BENGTSSON (1999) PAYNE, C.M., L. GLASSER, M.E. TISCHLER, D. WYCKOFF, D. CROMEY, R. FIEDERLEIN & O. BOHNERT (1994) TSUCHIDA, H., Y. TAKEDA, H. TAKEI, H. SHINZAWA, T. TAKAHASHI & F. SENDO (1995) WALSH, G.M., G. DEWSON, A.J. WARDLAW, F. LEVI-SCHAFFER & R. MOQBEL (1998) WALZOG, B., F. JEBLONSKI, A. ZAKRZEWICZ P. GAEHTGENS (1997) |
Ohne Hinweis auf eine Übernahme, die Quelle ist in der Mitte des wörtlich übernommenen Texts genannt. |
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