|
|
|
| Untersuchte Arbeit: Seite: 61, Zeilen: 1-23 |
Quelle: Becker 1999 Seite(n): 24, 25, Zeilen: 24: 1 ff.; 25: 1 ff. |
|---|---|
| 2.16.3 Die Messwertbestimmung von PCR-Produkten (Quantifizierung)
Zur Bestimmung von Messwerten aus den PCR-Produkten gibt es verschiedene Verfahren mit unterschiedlichen Vorteilen und Problemen. Insgesamt gibt es auch im Forschungsbereich eine Tendenz zu toxikologisch unbedenklichen Verfahren, die dennoch durch gleichzeitig verbesserte Techniken immer sensitiver werden. Radioaktivität Eine der ersten Methoden zur Quantifizierung war die Verwendung von Radioaktivität. Am einfachsten ist die Zugabe einer geringen Menge eines radioaktiven dNTPs zur PCR. Das Nukleotid wird während der PCR in das Produkt eingebaut. Über einen Szintillationszähler kann die Radioaktivität danach gemessen werden (SEIBEL et al. 1991). Von der Verwendung von Radioaktivität ist man heute eher abgekommen. Nicht-radioaktive Methoden sind von vergleichbarer Qualität und umgehen die umständliche Handhabung sowie die Entsorgung. ELISA ALARD stellt 1993 eine qPCR-Methode vor, welche biotinylierte Primer verwendet. Diese werden dann über einen ELISA optisch quantifiziert. Sie konnten IL2 mRNA aus 40 Jurkat Zellen quantifizieren. Anfärbung durch Fluoreszenzfarbstoffe und densitometrische Analyse Die Auftrennung verschiedener DNA-Fragmente mit Hilfe eines Gels und anschließende Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, meist Ethidiumbromid, ist heute eine molekularbiologische Standardmethode. Diese Methode kann einfach zur Bestimmung bei der kompetitiven PCR eingesetzt werden (CHEHADEH et al. 1995). Wegen der mangelnden Sensitivität kann sie jedoch nicht zur Bestimmung von PCR-Produkten bei der kinetischen PCR eingesetzt werden. |
1.4.4 Die Messwertbestimmung von PCR-Produkten (Quantifizierung)
Zur Bestimmung von Messwerten aus den PCR-Produkten gibt es verschiedene Verfahren mit unterschiedlichen Vorteilen und Problemen. Insgesamt gibt es auch im Forschungsbereich eine Tendenz zu toxikologisch unbedenklichen Verfahren, die dennoch durch gleichzeitig verbesserte Techniken immer sensitiver werden. 1.4.4.1 Radioaktivität Eine der ersten Methoden zur Quantifizierung war die Verwendung von Radioaktivität. Am einfachsten ist die Zugabe einer geringen Menge eines radioaktiven dNTPs zur PCR. Das Nukleotid wird während der PCR in das Produkt eingebaut. Über einen Szintillationszähler kann die Radioaktivität danach gemessen werden (Seibel, et al., 1991 a). Von der Verwendung von Radioaktivität ist man heute eher abgekommen. Nicht-radioaktive Methoden sind von vergleichbarer Qualität und umgehen das umständliche handling sowie die Entsorgung. 1.4.4.2 Antikörper Alard stellt 1993 eine qPCR-Methode vor, welche biotinylierte Primer verwendet. Diese werden dann über einen ELISA optisch quantifiziert. Sie konnten bis zu 16 pg eines 250 bp-Fragmentes nachweisen. [Seite 25:] 1.4.4.4 Anfärbung durch Fluoreszenzfarbstoffe Die Auftrennung verschiedener DNA-Fragment mit Hilfe eines Gels und anschließende Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoffs, meist Ethidiumbromid, ist heute eine molekularbiologische Standardmethode. Sie eignet sich zum Vergleichen etwa gleicher, großer Mengen an DNA. Diese Methode kann einfach zur Bestimmung bei der kompetitiven PCR eingesetzt werden (Chehadeh et al., 1995). Wegen der mangelnden Sensitivität kann sie jedoch nicht zur Bestimmung von PCR-Produkten bei der kinetischen PCR eingesetzt werden. |
Kein Hinweis auf die Quelle. |
|