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| Untersuchte Arbeit: Seite: 65, Zeilen: 1-21 |
Quelle: Bente 2003 Seite(n): 39, Zeilen: 1 ff. |
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| [ABBILDUNG]
Die Vorteile dieser Farbstoffe sind, dass sie preisgünstig sind und eine universelle Verwendbarkeit haben, da mit ihnen prinzipiell jede PCR verfolgt werden kann (BUSTIN 2000). Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, weil jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein großer Nachteil: Durch diese Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem Produkt und Artefakten (wie z.B. Primerdimern) unterscheiden. Entstehende Primerdimer und andere Artefakte binden ebenfalls SYBR Green™ und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben (VANDESOMPELE et al. 2002). Eine klare Differenzierung zwischen Primerdimer bzw. Artefakt und Zielfragment ist daher zwingend notwendig (VANDESOMPELE et al. 2002). Diesem Umstand wurde bei den interkalierenden Farbstoffen mit Hilfe der Schmelzpunktanalyse entgegen gewirkt (Abb.6): Dazu wird eine Schmelzpunktanalyse des Produkts am Ende der eigentlichen PCR durchgeführt (RIRIE et al. 1997). Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 °C Schritten von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierenden Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert (Abb.6). Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte (Abbildung 6). Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur grafisch auf, so kann man den [Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abbildung 6).] |
Die Vorteile dieser Farbstoffe sind, dass sie preisgünstig sind und eine universelle Verwendbarkeit haben, da mit ihnen prinzipiell jede PCR verfolgt werden kann (BUSTIN 2000). Außerdem haben sie eine hohe Signalstärke, weil jedes DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus den Vorteilen resultiert aber auch ein großer Nachteil: Durch diese Farbstoffe kann man prinzipiell nicht zwischen korrektem Produkt und Artefakten (wie z.B. Primerdimern) unterscheiden. Entstehende Primerdimer und andere Artefakte binden ebenfalls SYBR Green™ und führen somit zu einem unspezifischen Anstieg der Fluoreszenz auch in negativen Proben (VANDESOMPELE et al. 2002). Eine klare Differenzierung zwischen Primerdimer bzw. Artefakt und Zielfragment ist daher zwingend notwendig (VANDESOMPELE et al. 2002).
Diesem Umstand wurde bei den interkalierenden Farbstoffen mit Hilfe der Schmelzpunktanalyse entgegen gewirkt (Abb. 2.7): Dazu wird eine Schmelzpunktanalyse des Produkts am Ende der eigentlichen PCR durchgeführt (RIRIE et al. 1997). Das Reaktionsgemisch wird dabei in 1 °C Schritten von 50 °C auf 95 °C erhitzt und kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen. Der Punkt, an dem doppelsträngige DNA schmilzt, ist durch einen Abfall (Peak) der Fluoreszenz des interkalierenden Farbstoffes gekennzeichnet, da der interkalierenden Farbstoff von der einzelsträngigen DNA dissoziiert (Abb. 2.7, 2). Wenn die PCR optimal eingestellt ist, sollte ein Schmelzpunktpeak zu erwarten sein, der spitz zuläuft. Dieser Schmelzpunkt stellt das spezifische, zu erwartende Produkt dar. Unterschiedlich große Produkte und Produkte anderer Sequenz haben unterschiedliche Schmelzpunkte (Abb. 2.7, 2). Trägt man die Fluoreszenz gegen die Temperatur graphisch auf, so kann man den Fluoreszenzabfall beider Produkte als zwei getrennte Schmelzpunkte wahrnehmen (Abb. 2.7, 1). |
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