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| Untersuchte Arbeit: Seite: 25, Zeilen: 1-15 |
Quelle: Koch 2009 Seite(n): 31, 32, Zeilen: 31: 4ff; 32: 3ff |
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| Eine Normalisierung der Signalintensitäten gegen ein anderes Protein, ein so genanntes „housekeeping“ Protein ist wichtig, da dadurch Unterschiede, zum Beispiel in der Zellkonzentration der verschiedenen Wells oder auch kleine Unterschiede bei Inkubationszeiten, korrigiert werden können. Diese Referenzproteine gelten als unregulierte Proteine, von denen man annimmt, das sie in allen Zellen etwa gleich stark exprimiert werden. Das untersuchte Protein wird zum Referenzproteinen ins Verhältnis gesetzt.
Ausgehend von den isolierten Monozyten, wurden nun je 100μl der präparierten Monozytenlösung in die einzelnen Wells von 96well Platten verteilt, und mit 150μl Fixing Solution (4,5ml PBS + 0,5ml 35 % Formaldehyd) durch 20 minütiges Inkubieren an der Platte fixiert. Anschließend wurden die Zellen durch viermaliges Waschen mit je 200μl Washing Solution (49,5ml HBSS + 0,5ml 10 % Triton X100) für jeweils 5 Minuten permeabilisiert und damit für die spätere Zugabe der Antikörper vorbereitet. Mittels eines Magneten, können durch die superparamagnetische [sic] Dynabeads, welche die Monozyten festhalten, die zugegebenen Lösungen wieder entfernt werden, ohne dabei die am Boden haftenden Zellen zu verlieren. |
Eine Normalisierung der Signalintensitäten gegen ein anderes Protein, ein so genanntes „housekeeping“ Protein ist wichtig, da dadurch Unterschiede, zum Beispiel in der Zellkonzentration der verschiedenen Wells oder auch kleine Unterschiede bei Inkubationszeiten, korrigiert werden können. Diese Referenzproteine gelten als unregulierte Proteine, von denen man annimmt, das sie in allen Zellen etwa gleich stark exprimiert werden. Das untersuchte Protein wird zum Referenzproteinen ins Verhältnis gesetzt.
[Seite 32] Ausgehend von den isolierten Monozyten, wurden nun je 100μl der präparierten Monozytenlösung in die einzelnen Wells von 96well Platten verteilt, und mit 150μl Fixing Solution (4,5ml PBS + 0,5ml 35 % Formaldehyd) durch 20 minütiges Inkubieren an der Platte fixiert. Anschließend wurden die Zellen durch viermaliges Waschen mit je 200μl Washing Solution (49,5ml HBSS + 0,5ml 10 % Triton X100) für jeweils 5 Minuten permeabilisiert und damit für die spätere Zugabe der Antikörper vorbereitet. Mittels eines Magneten, können, durch die superparamagnetischen Dynabeads, welche die Monozyten festhalten, die zugegebenen Lösungen wieder entfernt werden, ohne dabei die am Boden haftenden Zellen zu verlieren. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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