von Dr. Florian Freese
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| [1.] Flf/Fragment 030 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-17 23:22:43 WiseWoman | Flf, Fragment, Freese 2010, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 30, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Freese 2010 Seite(n): 37, Zeilen: 9ff |
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| 3.2.2.2 RNA-Isolierung
Die RNA-Isolierung aus dem bei -80°C tiefgefrorenen Nierengewebe erfolgte über die Trizol-Methode. Dazu wurden 100 mg Gewebe in 1 ml eisgekühltem Trizol ca. 2x 30 sec mit dem Sono-Stab Polytron auf Eis homogenisiert und bei 5.000 Upm für 10 min bei 4°C zur Entfernung grober Partikel zentrifugiert. (Alle Zentrifugationsschritte erfolgten mit der Eppendorf Tischzentrifuge 5402, Hamburg, Deutschland). Der abpipettierte Überstand wurde zur kompletten Dissoziation der Nukleoprotein- Komplexe für ca. 1h bei Raumtemperatur gelagert und zur Phasenseparation mit 200 μl Chloroform/1 ml Trizol vermischt, für 2-3 min bei RT inkubiert und bei 12.000 Upm für 15 min bei 4°C zentrifugiert. Die RNA, die sich in der oberen durchsichtigen Phase befand, wurde mit 500 μl Isopropanol/1 ml Trizol präzipitiert und für 10 min bei RT gelagert. Anschließend wurde die RNA bei 12.000 Upm für 10 min bei 4° C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml 75%igem, -20°C kaltem Ethanol/1 ml Trizol gewaschen und bei 4.900 Upm für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes wurde das Pellet 5 min luftgetrocknet und in 50 μl DEPC-H2O bei 60° C in 5 min gelöst. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte über eine 1:200-Verdünnung mit DEPC-H2O im Photometer bei 260-280 nm. Zur Überprüfung der Integrität der RNA wurden 1 μl (ca. 500 ng) der RNA und 0,5 μl Laufpuffer in einem Gesamtvolumen von 6 ml auf ein 1%iges Agarose/Ethidiumbromid-Gel, bestehend aus 30 ml 1x TAE und 3 μl Ethidiumbromid (10 mg/ml), aufgetragen. Der Gellauf erfolgte bei einer Spannung von ca. 5 V/cm Elektrodenabstand und einer Stromstärke von ca. 200 mA über ungefähr 35 min. Die extrahierte RNA wurde anschliessend bei -80° C gelagert. |
3.2.2.1 RNA-Isolierung
Die RNA-Isolierung aus dem bei -80°C tiefgefrorenen Nierengewebe erfolgte über die Trizol-Methode. Dazu wurden 100 mg Gewebe in 1 ml eisgekühltem Trizol ca. 2x 30 sec mit dem Sono-Stab Polytron auf Eis homogenisiert und bei 5.000 Upm für 10 min bei 4°C zur Entfernung grober Partikel zentrifugiert. (Alle Zentrifugationsschritte erfolgten mit der Eppendorf Tischzentrifuge 5402, Hamburg, Deutschland). Der abpipettierte Überstand wurde zur kompletten Dissoziation der Nukleoprotein-Komplexe für ca. 1h bei Raumtemperatur gelagert und zur Phasenseparation mit 200 μl Chloroform/1 ml Trizol vermischt, für 2-3 min bei RT inkubiert und bei 12.000 Upm für 15 min bei 4°C zentrifugiert. Die RNA, die sich in der oberen durchsichtigen Phase befand, wurde mit 500 μl Isopropanol/1 ml Trizol präzipitiert und für 10 min bei RT gelagert. Anschließend wurde die RNA bei 12.000 Upm für 10 min bei 4° C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml 75%igem, -20°C kaltem Ethanol/1 ml Trizol gewaschen und bei 4.900 Upm für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes wurde das Pellet 5 min luftgetrocknet und in 50 μl EPCH 2O [sic] bei 60° C in 5 min gelöst. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte über eine 1:200-Verdünnung mit DEPC-H2O [sic] im Photometer bei 260-280 nm. Zur Überprüfung der Integrität der DNA wurden 1 μl (ca. 500 ng) der RNA und 0,5 μl Laufpuffer in einem Gesamtvolumen von 6 ml auf ein 1%iges Agarose/Ethidiumbromid- Gel, bestehend aus 30 ml 1x TAE und 3 μl Ethidiumbromid (10 mg/ml), aufgetragen. Der Gellauf erfolgte bei einer Spannung von ca. 5 V/cm Elektrodenabstand und einer Stromstärke von ca. 200 mA über ungefähr 35 min. Die extrahierte RNA wurde anschliessend bei -80° C gelagert. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Die verwendete Methode war wohl in der Quelle und der untersuchten Arbeit identisch. Trotzdem hätte eine Übereinstimmung im Wortlaut transparent gemacht werden müssen. |
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