|
|
|
| Untersuchte Arbeit: Seite: 37, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Freese 2010 Seite(n): 43, 44, 47, 48, Zeilen: 43: 1ff; 44: 1-15; 47: 1-2; 48: 9-10 |
|---|---|
| 3.2.2.5.2.2 Auswertung der PCR-Ergebnisse – Quantifizierungsstrategie
Zur Auswertung des TaqMan-assay wird die Strategie der relativen Quantifizierung mit Standardkurven verfolgt. Dabei wird das Expressionsniveau des untersuchten Gens auf die Expression eines housekeeping-Gens normiert. Ein housekeeping-Gen ist ein Gen, welches idealerweise ungeachtet experimenteller Bedingungen in vitro oder bei Krankheiten in vivo im untersuchten Gewebe konstant in der gleichen Menge exprimiert wird. Bekannte und häufig eingesetzte Vertreter dieser Klasse sind z.B. ß-Actin, GAPDH, Cyclophilin, 18S-rRNA, PBGD (Porphobilinogendeaminase) und andere. PBGD wurde in der vorliegenden Arbeit als housekeeping-Gen benutzt. Eine Normierung auf diesen endogenen Standard hat den Vorteil, dass z.B. verschiedene reverse Transkriptions Ansätze mit unterschiedlichen Effizienzen direkt miteinander verglichen werden und bei der Dosierung der RNA Pipettierfehler ausgeglichen werden können. Das Expressionslevel der zu bestimmenden mRNASequenz und der Sequenz des housekeeping-Gens wird mit Hilfe von Standardkurven bestimmt. Dazu werden PCR-Fragmente benutzt, die die beim TaqMan- Ansatz amplifizierten Sequenzen enthalten. Hierzu werden sieben serielle 1:10 Verdünnungen hergestellt, die auf jedem Ansatz des jeweiligen Gens als Standards bekannter Konzentrationen mitbestimmt werden. Die Zuordnung der Konzentrationen der Standards kann zwar absolut durch die enthaltene Kopienanzahl erfolgen, im Falle der hier gewünschten Analyse, nämlich eines relativen Vergleiches verschiedener Behandlungsgruppen miteinander, können vereinfachend arbiträre Einheiten korrespondierend zum Verdünnungsgrad gewählt werden. Dem ersten Standard wird dementsprechend die Konzentration 1 zugeordnet, dem zweiten Standard die Konzentration 0,1 usw. Trägt man die erhaltenen Ct Werte der Standards über den Logarithmus ihrer Konzentrationen auf, so erhält man eine Kalibriergerade, welche die Konzentrationsbzw. Expressionsbestimmung (E) der unbekannten Proben ermöglicht.
berechnet man die relative Expression (rE) des untersuchten Gens. Die erhaltenen Quotienten sind einheitenlos und haben keine reale Entsprechung. Die Werte eignen sich jedoch gut zum relativen Vergleich verschiedener Gruppen untereinander. |
[Seite 44]
Zur Auswertung des TaqMan-assay wird die relative Quantifizierung mit Standardkurven benutzt. Dabei wird das Expressionslevel des untersuchten Gens auf die Expression eines sog. housekeeping-Gens normiert. Ein housekeeping-Gen ist ein Gen, welches idealerweise ungeachtet experimenteller Bedingungen in vitro oder Krankheiten in vivo im untersuchten Gewebe konstant in der gleichen Menge exprimiert wird. Bekannte und häufig eingesetzte Vertreter dieser Klasse sind z.B. ß-Actin, GAPDH, Cyclophilin, 18S-rRNA, PBGD (Porphobilinogen Deaminase) und andere. 18- S-rRNA wurde in der vorliegenden Arbeit als housekeeping-Gen benutzt. Eine Normierung auf diesen endogenen Standard hat den Vorteil, dass z.B. verschiedene reverse Transkriptions-Ansätze mit möglicherweise unterschiedlichen Effizienzen direkt miteinander verglichen werden und Pipettierfehler bei der Dosierung der RNA ausgeglichen werden können. Das Expressionslevel der zu bestimmenden mRNASequenz und der Sequenz des housekeeping-Gens wird mit Hilfe von Standardkurven bestimmt. Dazu werden PCR-Fragmente benutzt, die die beim TaqMan-assay [Seite 44] amplifizierten Sequenzen enthalten. Es werden sieben serielle 1:10 Verdünnungen hergestellt, die auf jedem assay des jeweiligen Gens als Standards bekannter Konzentrationen mitbestimmt werden. Die Zuordnung der Konzentrationen der Standards kann zwar absolut durch die enthaltene Kopienanzahl (photometrisch bestimmt) erfolgen, im Falle der hier gewünschten Analyse, nämlich eines relativen Vergleiches verschiedener Behandlungsgruppen miteinander, können vereinfachend arbiträre Einheiten korrespondierend zum Verdünnungsgrad gewählt werden. Dem ersten Standard wird dementsprechend die Konzentration 1 zugeordnet, dem zweiten Standard die Konzentration 0,1 usw. Trägt man die erhaltenen CDs der Standards über den Logarithmus ihrer Konzentrationen auf, so erhält man eine Kalibriergerade, welche die Konzentrationsbzw. Expressionsbestimmung (E) der unbekannten Proben ermöglicht. Die erhaltenen Quotienten sind einheitenlos und haben keine reale Entsprechung. Die Werte eignen sich jedoch gut zum relativen Vergleich verschiedener Gruppen untereinander. [Seite 47] 3.2.2.5.2 Auswertung der PCR-Ergebnisse 3.2.2.5.2.1 Quantifizierungsstrategie
berechnet man die relative Expression (rE) des untersuchten Gens. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
|