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| Untersuchte Arbeit: Seite: 16, Zeilen: 01-31 (komplett) |
Quelle: Soltanpour 2004 Seite(n): 16-17, Zeilen: S.16,1ff (komplett) - S.17,1-3 |
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| 3. Methoden
3.1. Präparation isolierter Herzmuskelzellen und deren Inkubation Zu Beginn der Präparation von Ca++-toleranten Herzmuskelzellen wurde eine Langendorff-Apparatur zunächst mit Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer (KRB-Puffer) gespült und danach mit dem gleichen Puffer luftblasenfrei gefüllt. Während der gesamten Herzzellisolierung wurde die Perfusionslösung weiter mit Carbogen begast. Zur Isolierung von ventrikulären Myokardzellen wurden ca. 12 Wochen alte, 300- 350g schwere, männliche Wistar-Ratten aus dem Tierstall des Physiologischen Instituts, Justus-Liebig-Universität Gießen, mit Diethylether narkotisiert und thorakotomiert. Die Herzen wurden mit eiskalter 0,15 M NaCl-Lösung still gestellt und oberhalb des Aortenbogens abgetrennt, danach die Lungenflügel entfernt und die Aorta frei präpariert. Bei langsam laufender Perfusion mit dem KRB-Puffer (ca. 30 Tropfen/min) wurden die Herzen mit der frei präparierten Aorta an die Langendorff-Apparatur angehängt und mit 40 ml pro Herz blutfrei perfundiert. Anschließend wurde für 30 min mit Kollagenasepuffer (2-3 ml/min) rezirkulierend perfundiert. Nach Beendigung der Perfusion wurden die Vorhöfe entfernt, und das Ventrikelgewebe mit einem Gewebehacker (Tissue Chopper 1086, Bachofer, Reutlingen) bei einer Schnittbreite von 0,7 mm mechanisch zerkleinert. Im Kollagenasepuffer mit 1% Albumin wurde das Gewebe während eines 15-20 minütigen wiederholten Ansaugens mit einer 10 ml-Pipette weiter aufgetrennt. Die so gewonnene Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur durch ein Nylonnetz mit 200 μm Porengröße filtriert, um Bindegewebsstücke abzutrennen. Das Filtrat wurde für 3 min bei 400 Upm zentrifugiert (Digifuge GL, Heraeus-Christ, Osterode/Harz), um Zelltrümmer und kleinere Zellen, wie z.B. Endothelzellen, von intakten Myozyten zu trennen. Das Sediment wurde im KRB-Puffer + 0,2 mM CaCl2 resuspendiert und erneut bei 400 Upm für 3 min zentrifugiert. Intakte Ca++-tolerante Myozten [sic!] wurden durch Sedimentation durch ein Medium hoher Dichte aufkonzentriert. Hierfür wurden vier hohe Reagenzgläser bis zur Hälfte mit dem KRB-Puffer + 4 % Albumin + 1 mM CaCl2 gefüllt und die Zellsuspension mit einer gebogenen Pasteurpipette vorsichtig überschichtet. Zur beschleunigten Sedimentation wurden diese Reagenzgläser bei 300 Upm für 30 Sekunden zentrifugiert (Sigma 4K-1; Sigma, Taufkirchen). |
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3. Kapitel: Methoden 3.1. Präparation isolierter Herzmuskelzellen und deren Inkubation Zu Beginn der Präparation von Ca++-toleranten Herzmuskelzellen wurde eine Langendorff-Apparatur zunächst mit Krebs-Ringer-Bikarbonatpuffer (KRB-Puffer) gespült und danach mit dem gleichen Puffer luftblasenfrei gefüllt. Während der gesamten Herzzellisolierung wurde die Perfusionslösung weiter mit Carbogen begast. Zur Isolierung von ventrikulären Myokardzellen wurden ca. 12 Wochen alte, 300- 350g schwere, männliche Wistar-Ratten aus dem Tierstall des Physiologischen Instituts, Justus-Liebig-Universität Giessen, mit Diethylether narkotisiert und thorakotomiert. Die Herzen wurden mit eiskalter 0,15 M NaCl-Lösung stillgestellt und oberhalb des Aortenbogens abgetrennt, danach die Lungenflügel entfernt und die Aorta freipräpariert. Bei langsam laufender Perfusion mit dem KRB-Puffer (ca. 30 Tropfen/min) wurden die Herzen mit der freipräparierten Aorta an die Langendorff-Apparatur angehängt und mit 40 ml pro Herz blutfrei perfundiert. Anschließend wurde für 30 min mit Kollagenasepuffer (2-3 ml/min) rezirkulierend perfundiert. Nach Beendigung der Perfusion wurden die Vorhöfe entfernt, und das Ventrikelgewebe mit einem Gewebehacker (Tissue Chopper 1086, Bachofer, Reutlingen) bei einer Schnittbreite von 0,7 mm mechanisch zerkleinert. Im Kollagenasepuffer mit 1% Albumin wurde das Gewebe während eines 15-20-minütigen wiederholten Ansaugens mit einer 10 ml-Pipette weiter aufgetrennt. Die so gewonnene Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur durch ein Nylonnetz mit 200 μm Porengrösse filtriert, um Bindegewebsstücke abzutrennen. Das Filtrat wurde für 3 min bei 400 Upm zentrifugiert (Digifuge GL, Heraeus-Christ, Osterode/Harz), um Zelltrümmer und kleinere Zellen, wie z.B. Endothelzellen, von intakten Myozyten zu trennen. Das Sediment wurde im KRB-Puffer + 0,2 mM CaCl2 resuspendiert und erneut bei 400 Upm für 3 min zentrifugiert. Intakte Ca++-tolerante Myozyten wurden durch Sedimentation durch ein Medium hoher Dichte aufkonzentriert. Hierfür wurden vier hohe Reagenzgläser bis zur Hälfte mit dem KRB-Puffer + 4% Albumin + 1 mM CaCl2 gefüllt und die Zellsuspension mit einer [Seite 17] gebogenen Pasteurpipette vorsichtig überschichtet. Zur beschleunigten Sedimentation wurden diese Reagenzgläser bei 300 Upm für 30 Sekunden zentrifugiert (Sigma 4K-1; Sigma, Taufkirchen). |
Identisch, ohne jeden Hinweis auf eine Übernahme. |
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