von Maryam Salahshour-Fard
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| [1.] Msf/Fragment 011 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-06-29 08:39:22 Singulus | Fragment, Gesichtet, Hoernschemeyer 2001, Msf, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 11, Zeilen: 1 ff. (kpl.) |
Quelle: Hoernschemeyer 2001 Seite(n): 9-10, Zeilen: 7ff.; 1 ff. |
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| [Dass hierbei u.U. auch Artefakte durch die Anwendung solcher Verfahren entstehen können, wird in] Abbildung 4 deutlich. In der rechten unteren Grafik wird eine mögliche Quervernetzung mehrerer Mikrodomänen miteinander durch die Anbindung von bifunktionellen Antikörpern bzw. chemischen Substraten gezeigt.
Als eine Möglichkeit zur Isolation von Rafts aus Zellen wird die Detergenz-unterstützte Lyse bei 4°C mit anschließender Ultrazentrifugation angewendet. Dieses von Brown und Rose (1992) entwickelte Verfahren basiert auf der Verwendung eines Lysis-Puffers, welcher bis zu 1% Triton-X-100 enthält. Dabei werden Mikrosomen und liposomale Körperchen von den in den Mikrodomänen enthaltenen Lipiden und Proteinen ausgebildet, die in 40%-iger Saccharose eine niedrige Dichte besitzen und somit im Dichtegradienten in oberen [sic] Bereiche des Zentrifugenröhrchens „schweben“ (London & Brown 2000). Es konnte nachgewiesen werden, dass bei 37°C keine „schwimmende Fraktion“ mehr erhalten wird, so dass man davon ausgehen kann, dass hierbei die Zelllyse vollständig war und Mikrodomänen bzw. Liposomenbildung durch die Detergenzwirkung aufgelöst bzw. verhindert wurden. So konnte weiterhin gezeigt werden, dass die plazentale alkalische Phosphatase (PLAP), ein GPI-verankertes Protein, welches vermutlich in Rafts lokalisiert ist, nach Extraktion aus Liposomen bei 4°C nur Triton-X-100-unlöslich war, wenn dieses sich in einer Lipidumgebung befand, in der die Lipide überwiegend gesättigte Fettsäuren trugen (33% Sphingolipide und 33% Cholesterin). Hingegen war das raft-assoziierte Protein Triton-X-100-löslich, wenn der Sphingolipid-Anteil auf 10% gesenkt wurde, in dem man z. B. Cholesterin mit Hilfe von Cyclodextrin entfernt hat (Schroeder et al., 1998). Allerdings wurde in den vergangenen Jahren auch dieses Verfahren kontrovers diskutiert, da durch das Einwirken des Detergenz auf die Zellen möglicherweise bestimmte Lipide, wie z.B. Phospholipide, solubilisiert werden könnten, wohingegen andere wie Glykosphingolipide und Cholesterin unlöslich zurückbleiben und die Rafts-Fraktion bilden. Ein Beweis für die Existenz dieser Mikrodomänen in vivo konnte mit dieser Methode bislang nicht hinreichend geführt werden. Allerdings konnten mittlerweile auch durch andere unabhängige Methoden vermehrt Hinweise auf die Richtigkeit der von Brown und Rose erhaltenen Ergebnisse gefunden werden. |
Dass hierbei u.U. auch Artefakte durch die Anwendung solcher Verfahren entstehen können, soll die Abbildung 1.3 verdeutlichen. In der rechten unteren Grafik wird eine mögliche Quervernetzung mehrerer Mikrodomänen miteinander durch die Anbindung von bifunktionellen Antikörpern bzw. chemischen Substraten gezeigt.
Als eine Möglichkeit zur Isolation von „rafts“ aus Zellen wird die Detergenz-unterstützte Lyse bei 4°C mit anschließender Ultrazentrifugation angewendet. Dieses von Brown und Rose (1992) entwickelte Verfahren basiert auf der Verwendung eines Lysis-Puffers, welcher bis zu 1 % Triton-X-100 enthält. Dabei werden Mikrosomen und liposomale Körperchen von den in den Mikrodomänen enthaltenen Lipiden und Proteinen ausgebildet, die in 40 %-iger Saccharose eine niedrige Dichte besitzen und somit im Dichtegra- [Seite 10:] dienten in obere Bereiche des Zentrifugenröhrchens „schweben“ (Übersicht in London und Brown, 2000). Es konnte nachgewiesen werden, dass bei 37°C keine „schwimmende Fraktion“ mehr erhalten wird, so dass man davon ausgehen kann, dass hierbei die Zelllyse vollständig war und Mikrodomänen bzw. Liposomenbildung durch die Detergenzwirkung aufgelöst bzw. verhindert wurden. So konnte weiterhin gezeigt werden, dass die plazentale alkalische Phosphatase (PLAP), ein GPI-verankertes Protein, welches vermutlich in „rafts“ lokalisiert ist, nach Extraktion aus Liposomen bei 4°C nur Triton X-100-unlöslich war, wenn dieses sich in einer Lipidumgebung befand, in der die Lipide überwiegend gesättigte Fettsäuren trugen (33 % Sphingolipide und 33 % Cholesterol). Hingegen war das Protein Triton X-100-löslich, wenn der Sphingolipid-Anteil auf 10 % gesenkt wurde (Schroeder et al., 1998). Allerdings wurde in den vergangenen Jahren auch dieses Verfahren kontrovers diskutiert, da durch das Einwirken des Detergenz auf die Zellen möglicherweise bestimmte Lipide, wie z.B. Phospholipide, solubilisiert werden könnten, wohingegen andere wie Glykosphingolipide und Cholesterol unlöslich zurückbleiben und die „rafts“-Fraktion bilden. Ein Beweis für die Existenz dieser Mikrodomänen in vivo konnte mit dieser Methode bislang nicht hinreichend geführt werden. Allerdings konnten mittlerweile auch durch andere unabhängige Methoden vermehrt Hinweise auf die Richtigkeit der von Brown und Rose erhaltenen Ergebnisse gefunden werden. |
Kein Hinweis auf die Quelle. |
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