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| Untersuchte Arbeit: Seite: 39, Zeilen: 3-27 |
Quelle: Wuestholz 2004 Seite(n): 53, 54, Zeilen: 53: 25 ff.; 54: 1 ff. |
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| Zur Trennung der Zelllysate in Membranfraktion wurde eine bereits veröffentlichte Methode mit einigen Modifikationen angewandt.
Sofort nach Inkubation der Zellen mit den entsprechenden Stimulantien wurden sie zweimal kurz mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit Hilfe eines Zellschabers vorsichtig vom Zellboden gelöst und in 80 μl Lysispuffer, dem zur Proteaseinhibition ein Mix aus Benzamidin, Leupeptin, Thrypsin Inhibitor [je 10 μg/ml], Dithiothreitol (DTT) [10mM] und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) [1mM] frisch zugesetzt wird, resuspendiert. Dieser und alle folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden für zwei sek sonifiziert (10% Power) und 10 min auf Eis inkubiert. Nach der Ultrazentrifugation (Optima TLX Ultrazentrifuge Beckman) bei 100.000g für 30 min und 4°C wurde der Zellüberstand abgenommen (Zytosolfraktion). Für die nachfolgende Protein-bestimmung (s. 2.9.5) wurde pro Probe ein Aliquot von je 10 μl separiert, bevor alle Proben bei -80°C gelagert wurden. Die Zellpellets wurden anschließend in 45 μl Lysispuffer vorsichtig resuspendiert und wieder bei 100.000g und 4°C für 30 min zentrifugiert. Dieser Zellüberstand wurde als so genannte Waschfraktion verworfen. Die verbleibenden Zellpellets wurden in 55 μl Lysispuffer resuspendiert, der zusätzlich mit 0,2% Triton X-100 (v/v) versetzt werde, und für 15 sek. sonifiziert (10% Power). Nach der Inkubation auf Eis für 10 min wurden die Extrakte erneut bei 100.000g und 4°C für 30 min zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen (Membranfraktion) und pro Probe wurde ein Aliquot von 10 μl für die Proteinbestimmung (s. 2.9.5) entnommen, bevor alle Proben bei -80°C eingefroren wurden. |
Zur Trennung der Zelllysate in Zytosol- und Membranfraktion wird eine bereits veröffentlichte Methode mit einigen Modifikationen angewandt [145].
Sofort nach Inkubation der Zellen mit den entsprechenden Stimulantien werden sie zweimal kurz mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen werden mit Hilfe eines Zellschabers vorsichtig [Seite 54] vom Zellboden gelöst und in 80 μl Lysepuffer, dem zur Proteaseinhibition ein Mix aus Benzamidin, Leupeptin, Thrypsin Inhibitor [je 10μg/ml], Dithiothreitol (DTT) [10mM] und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) [1mM] frisch zugesetzt wird, resuspendiert. Dieser und alle folgenden Schritte werden bei 4 °C durchgeführt. Die Zellen werden für zwei Sekunden sonifiziert (10% Power) und 10 min auf Eis inkubiert. Nach der Ultrazentrifugation (Beckman OptimaTM TL) bei 100000xg für 30 min und 4 °C wird der Zellüberstand abgenommen (Zytosolfraktion). Für die nachfolgende Proteinbestimmung wird pro Probe ein Aliquot von je 23 μl separiert, bevor alle Proben bei -80 °C gelagert werden. Die Zellpellets werden anschließend in 45 μl Lysepuffer vorsichtig resuspendiert und wieder bei 100000xg und 4 °C für 30 min zentrifugiert. Dieser Zellüberstand wird als so genannte Waschfraktion verworfen. Die verbleibenden Zellpellets werden in 55 μl Lysepuffer resuspendiert, der zusätzlich mit 0,2 % (V/V) Triton X-100 versetzt wird, und für 15 Sekunden sonifiziert (10% Power). Nach der Inkubation auf Eis für 10 min werden die Extrakte erneut bei 100000xg und 4 °C für 30 min zentrifugiert. Die Überstände werden abgenommen (Membranfraktion) und pro Probe wird ein Aliquot von 17 μl für die Proteinbestimmung entnommen, bevor alle Proben bei -80 °C eingefroren werden. 145. Hong, D. H., J. Huan, B. R. Ou, J. Y. Yeh, T. C. Saido, P. R. Cheeke, and N. E. Forsberg, Protein kinase C isoforms in muscle cells and their regulation by phorbol ester and calpain, 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1267 (1), 45-54 |
Kein Hinweis auf die Quelle. |
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