Angaben zur Quelle [Bearbeiten]
| Autor | Maryam Salahshour-Fard |
| Titel | Die Rolle von Membranlipiden in der UVA-induzierten Signaltransduktion in humanen Keratinozyten |
| Ort | Düsseldorf |
| Jahr | 2006 |
| Anmerkung | Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf |
| URL | http://d-nb.info/980898390/34 |
Literaturverz. |
nein |
| Fußnoten | nein |
| Fragmente | 3 |
| [1.] Ati/Fragment 089 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-12-24 13:29:05 WiseWoman | Ati, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Salahshour-Fard 2006, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 89, Zeilen: 1-9 |
Quelle: Salahshour-Fard 2006 Seite(n): 55, Zeilen: 9-21 |
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| [Das Chromatogramm wird wie bei der PMD-Technik in mehreren Schritten in der gleichen Richtung entwickelt, bei dem jeder Einzellauf über eine größere Trennstrecke führt als der vorangegangene. Im Unterschied dazu kann aber für jeden] Lauf ein anderes Fließmittel verwendet werden. Dazu wird nach jeder Teilentwicklung das Fließmittel vollständig von der Kammer abgezogen. Um eine Artefaktbildung durch Wärmeeinwirkung zu vermeiden, wird die Zwischentrocknung durch Unterdruck durchgeführt.
Bei der Trennung von Substanzen, die einen großen Polaritätsbereich umfassen, eignet sich ein Universalgradient ebenso wie zur Trennung von Stoffen unbekannten chromatographischen Verhaltens. Anders als bei der Säulenchromatographie beginnt an Kieselgel als stationäre Phase der Gradient mit dem polarsten Fließmittel, mit dem über die kürzeste Laufstrecke entwickelt wird, und endet mit dem unpolarsten, das über die größte Trennstrecke führt [Böcker 1997]. |
Das Chromatogramm wird in mehreren Schritten in der gleichen Richtung entwickelt, bei dem jeder Einzellauf über eine größere Trennstrecke führt als der vorangegangene und für jeden Lauf ein anderes Fließmittel verwendet werden kann. Dazu wird nach jeder Teilentwicklung das Fließmittel vollständig von der Kammer abgezogen. Um eine Artefaktbildung durch Wärmeeinwirkung zu vermeiden, wird die Zwischentrocknung durch Unterdruck durchgeführt.
Bei der Trennung von Substanzen, die einen großen Polaritätsbereich umfassen, eignet sich ein Universalgradient ebenso wie zur Trennung von Stoffen unbekannten chromatographischen Verhaltens. Anders als bei der Säulenchromatographie beginnt an Kieselgel als stationäre Phase der Gradient mit dem polarsten Fließmittel, mit dem über die kürzeste Laufstrecke entwickelt wird, und endet mit dem unpolarsten, das über die größte Trennstrecke führt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Dieser Passage ist ähnlich auch in der angegebenen Quelle [Böcker] zu finden. Siehe: Ati/Dublette/Fragment 089 01 |
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| [2.] Ati/Fragment 090 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-12-24 13:22:33 WiseWoman | Ati, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Salahshour-Fard 2006, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 90, Zeilen: 1 ff. (kpl., ohne Abb. 5.5) |
Quelle: Salahshour-Fard 2006 Seite(n): 56 f., Zeilen: 56: 3 ff.; 57: 1-4 |
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| Die erste Entwicklungsstufe erfolgt mit 100% Methanol und in den darauf folgenden Stufen wird ein Methanol-Dichlormethan-Gemisch benutzt, schließlich wird der Methanol-Gehalt auf Null reduziert.
Die AMD-Technik ist damit eine fokussierende Chromatographie. Der untere Teil der Substanzzone wird vom aufsteigenden Fließmittel zuerst erfasst und beginnt seine Wanderung in Chromatographierichtung, wodurch die Fraktion zu einem schmalen Band fokussiert wird.
Durch Zusammenwirken von Fokussiereffekt und Gradientenentwicklung werden äußerst schmale Trennzonen erzielt, deren Peakbreiten unabhängig von der Wanderungsstrecke sind. Typische Halbwertsbreiten liegen bei 1 mm, so dass auf der zur Verfügung stehenden Trennstrecke von 80 mm bis zu 40 Komponenten vollständig getrennt werden können (Basislinien-Trennung). Die instrumentelle Dünnschicht-Chromatographie, gekoppelt mit einer automatischen Mehrfachentwicklung und Verwendung eines Polaritätsgradienten, zeichnet sich durch eine enorme Steigerung der analytischen Leistungsfähigkeit aus. Der Aufwand für eine reproduzierbare Mehrfachentwicklung ist nur mit einem entsprechenden Automaten vertretbar. Alle Parameter, die Einfluss auf die chromatographische Trennung haben, werden vom System automatisch gesteuert bzw. konstant gehalten. Dies ist bisher die einzige Methode, mit der eine reproduzierbare Gradientenentwicklung in der Dünnschicht-Chromatographie möglich ist [Lodi et al 1991]. Mit dem Universalgradienten können Substanzen aus einem sehr großen Polaritätsbereich in einem Chromatogramm auf Anhieb getrennt werden. Je nach Gradientenauswahl kann dabei eine vollständige Analyse aber bis zu mehreren Stunden dauern. Böcker, J.; Chromatographie : instrumenteile Analytik mit Chromatographie und Kapillarelektrophorese, 1. AufL, Würzburg, Vogel, 1997; 286-289. Lodi, G., Betti, A., Menziani, E., Brandolini, V., Tosi, B.; Some examples of automated multiple development (AMD) gradient optimization. J. Planar Chromatgr. 1991; 4; 106-110. |
Die erste Stufe erfolgt mit 100% Methanol und in den darauf folgenden Stufen wird ein Methanol-Dichlormethan-Gemisch benutzt. Am Ende wird der Methanol-Gehalt auf Null reduziert.
Die AMD-Technik ist eine fokussierende Chromatographie. Der untere Teil der Substanzzone, welcher das polarste ist, wird vom aufsteigenden Fleißmittel [sic] zuerst erfasst und beginnt seine Wanderung in Chromatographierichtung, wodurch die Fraktion zu einem schmalen Band fokussiert wird. Durch Zusammenwirken von Fokussiereffekt und Gradientenentwicklung werden äußerst schmale Trennzonen erzielt, deren Peakbreiten unabhängig von der Wanderungsstrecke sind. Typische Halbwertsbreiten liegen bei 1 mm, so dass auf der zur Verfügung stehenden Trennstrecke von 80 mm bis zu 40 Komponenten vollständig getrennt werden können (Basislinien-Trennung). Die instrumentelle Dünnschicht-Chromatographie, gekoppelt mit einer automatischen Mehrfachentwicklung und Verwendung eines Polaritätsgradienten, zeichnet sich durch eine enorme Steigerung der analytischen Leistungsfähigkeit aus. Der Aufwand für eine reproduzierbare Mehrfachentwicklung ist nur mit einem entsprechenden Automaten vertretbar. Alle Parameter, die Einfluss auf die chromatographische Trennung haben, werden vom System automatisch gesteuert bzw. konstant gehalten. Dies ist bisher die einzige Methode, mit der eine reproduzierbare Gradientenentwicklung in der Dünnschichtchromatographie möglich ist (Lodi 1964). [Seite 57:] Mit dem Universalgradienten können Substanzen aus einem sehr großen Polaritätsbereich in einem Chromatogramm auf Anhieb getrennt werden. Je nach Gradientenauswahl kann dabei eine vollständige Analyse aber bis zu mehrere [sic] Stunden dauern. Lodi F. 1964. [Gas chromatographic detection and determination of parathion with an electron-capture detector]. Farmaco [Prat.] 19:560-6 |
Kein Hinweis auf die Quelle. Man beachte dass die Quelle als Literaturverweis Lodi (1964) angibt, ein auf Italienisch geschriebener Originalartikel, während Ati einen fast 30 Jahre später in einer in Ungarn herausgegebenen Publikation erschienenen Artikel referenziert, der von einem anderen Autor gleichen Nachnamens verfasst wurde. Man beachte auch, dass sich der übernommene Text schon bei Böcker (1997) finden lässt: Ati/Dublette/Fragment_090_01 |
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| [3.] Ati/Fragment 097 11 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-10-25 05:10:57 Hindemith | Ati, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Salahshour-Fard 2006, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 97, Zeilen: 11-28 |
Quelle: Salahshour-Fard 2006 Seite(n): 63, Zeilen: 8 ff. |
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| 5.11 Analyse der Genexpression
5.11.1 Aufschluss der Zellen und Nukleinsäureisolierung Für die Untersuchung der Genexpression wurde Gesamt-RNS eingesetzt, die mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) aus den Zellen isoliert wird. Zur Lyse der Zellen wurden 600 pl Lysepuffer RET auf den angetauten Zellen verteilt. Dieser Lysepuffer enthält eine hohe Konzentration an Guanidiniumisothiocyanat, ein denaturierendes chaotropes Salz, welches sowohl zur Lyse der Zellen beiträgt, als auch die Wirkung von RNasen wirksam hemmt und damit die Isolierung intakter RNS erlaubt. Außerdem ermöglicht es durch die Zerstörung der geordneten Struktur der Wassermoleküle und ihrer Wechselwirkung mit den gelösten Nukleinsäuren die Bindung der Nukleinsäuren an die Silikagel-Matrix der Zentrifugenröhrchen. Die Zellen mit dem Lysepuffer wurden mit einem Zellschaber abgelöst, anschließend mit einer Tuberkulinspritze aufgenommen und durch wiederholtes Auspressen und Aufziehen durch die Wirkung der Scherkräfte homogenisiert. Nach Zugabe von 600 pl Ethanol (70%) und gründlichem Mischen wurde das Lysat in zwei Durchgängen über die Filtrationssäulchen mit der Silikagelmembran bei 10.000 x g für eine Minute zentrifugiert. Dabei erfolgt nur eine Absorption der Nukleinsäuren an der Membran, während andere Kontaminationen aus der Zelllyse in den folgenden Waschschritten mit den Puffern RW1 und RPE effizient entfernt wurden. |
2.11.7 Analyse der Genexpression
2.11.7.1 Aufschluß der Zellen und RNS-Isolierung Für die Untersuchung der Genexpression wurde Gesamt-RNS eingesetzt, die mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden) aus den Zellen isoliert wurde. [...] Zur Lyse der Zellen wurden 600 μl Lysepuffer RLT, dem 1% β-Mercaptoethanol zugesetzt wurde, auf den noch nicht ganz aufgetauten Zellen verteilt. Dieser Puffer enthält eine hohe Konzentration an Guanidiniumisothiocyanat, ein denaturierendes chaotropes Salz, welches sowohl zur Lyse der Zellen beiträgt, wie auch die Wirkung von RNasen wirksam hemmt und damit die Isolierung intakter RNS erlaubt. Außerdem ermöglicht es durch die Zerstörung der geordneten Struktur der Wassermoleküle und ihrer Wechselwirkung mit den gelösten Nukleinsäuren die Bindung der Nukleinsäuren an die Silikagel-Matrix der Zentrifugenröhrchen. Die Zellen mit dem Lysepuffer wurden mittels Zellliftern abgelöst, mit einer Tuberkulinspritze mit Kanüle (0,5 x 16 mm) aufgenommen und homogenisiert. Nach Zugabe von 600 μl 70% Ethanol und gründlichem Mischen wurde das Lysat in zwei Durchgängen über die Filtrationssäulchen mit der Silikagelmembran abzentrifugiert (1 min, 10.000g). Dabei erfolgte nur eine Absorption der Nukleinsäuren an der Membran, während andere Kontaminationen aus der Zelllyse in den folgenden Waschschritten mit den Puffern RW1 und RPE effizient entfernt wurden. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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