von Dr. Xavier Santamaria Costa
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| [1.] Xsc/Fragment 046 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-11-17 21:52:56 Hindemith | Cervello 2009, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung, Xsc |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 46, Zeilen: 1 ss. (página entera) |
Quelle: Cervello 2009 Seite(n): 50, 51, Zeilen: 50: 5 ss.; 51: 1 ss. |
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| [Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena a la temperatura óptima de esta ADN polimerasa,] normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su mantenimiento.
La técnica de PCR semi-cuantitativa se usa para determinar la presencia o ausencia de las secuencias buscadas. La PCR semi-cuantitativa fue conformada con 4μL del producto del paso de la retrotranscripción. A ese volumen de ADNc le fue añadido la mezcla de reacción que contenía 2,5 μL de tampón de reacción 10X (SYBR-Green, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), 1,25 μL de MgCl2 50mM (SYBR-Green), 15,5 μL de agua DEPC, 0,5 μL de mezcla de dNTPs (SYBR-Green), 0,5 μL de cebadores 5´ y 3´ a 20mM, 0,25 μL de Taq pol hasta llegar a un volumen final de 25 μL. Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un termociclador Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Como control negativo de la técnica en cada PCR se sustituyó el ADNc por agua bidestilada comprobando en estos casos que no existía amplificado alguno. Las secuencias de los cebadores utilizados se diseñó mediante el programa informático Primer BLAST y los tamaños y temperaturas de annealiing del fragmento que amplifica se muestran en la siguiente tabla. |
Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena a la temperatura óptima de esta ADN polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su mantenimiento.
La técnica de PCR semi-cuantitativa se usa para determinar la presencia o ausencia de las secuencias buscadas. La PCR semi-cuantitativa fue conformada con 4μL del producto del paso de la retrotranscripción. A ese volumen de ADNc le fue añadido la mezcla de reacción que contenía 2,5 μL de tampón de reacción 10X (Bioline, Londres, Inglaterra), 1,25 μL de MgCl2 50mM (Bioline), 15,5 μL de agua DEPC, 0,5 μL de mezcla de dNTPs (Sigma-Aldrich, Madrid, España), 0,5 μL de cebadores 5´ y 3´ a 20mM, 0,25 μL de Taq pol (Bioline) hasta llegar a un volumen final de 25 μL. Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un termociclador UnoII (Biometra, Gottingen, Alemania). Como control negativo de la técnica en cada PCR se sustituyó el [página 51] ADNc por agua bidestilada comprobando en estos casos que no existía amplificado alguno. Las secuencias de los cebadores utilizados se diseñó mediante programas informáticos y los tamaños del fragmento que amplifica se muestran en la siguiente tabla. |
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